Fiskevirus påvises raskere med ny metode

Infeksiøs pankreasnekrose (IPN) er en alvorlig sykdom som hvert år fører til store tap for laksenæringen. Ny kunnskap om infeksjonsmekanismen og ny diagnostisk metode kan bety bedre kontroll med sykdommen og enklere diagnostikk.

Publisert

IPN-virus som forårsaker sykdommen, er utbredt i norsk laks- og ørretoppdrett. Viruset er påvist i mange ulike fiskearter og også i skjell og bløtdyr.

Laksefisk som overlever sykdommen, blir ofte bærere av viruset, og kan være en potensiell smittekilde for andre individer.

Alle virus er avhengige av vertsceller for å formere seg. Irene Ørpetveit ved Norges veterinærhøgskole har studert samspillet mellom virus og vertsceller tidlig i infeksjonsforløpet.

Formålet har vært å avdekke hvordan viruset kommer seg inn i cellene, hvorfor noen arter smittes og andre ikke, og hvordan fiskens immunforsvar bekjemper virusinfeksjonen.

Opptak av virus i cellen

Infeksjonen starter med at IPN-viruset binder seg til spesielle proteinmolekyler på overflaten av en rekke ulike celletyper.

– Dette tyder på at opptaksmekanismen som IPN-viruset benytter, blir aktivert når viruset binder seg til disse molekylene på celleoverflaten, sier Ørpetveit.

Der viruset fester seg til cellemembranen, buktes denne inn, omslutter viruset og snøres av som en blære inne i cellen. Så frigjøres virus til cellens cytoplasma. Mange virus er avhengig av surt miljø (lav pH-verdi) i membranblæren for at opptaksprosessen skal fullføres.

IPN-virus tas opp uavhengig av pH, men det gjenstår ennå en del arbeid før man har definert hele opptaksmekanismen. 

Den tradisjonelle metoden for påvisning av IPN-virus, er dyrking av virus i cellekultur. Dette er veldig tidkrevende. Ørpetveit arbeidet derfor parallelt med utvikling av en molekylærbiologisk metode for raskere påvisning av dette viruset.

– Dette er en såkalt real time RT-PCR-metode hvor det påvises gensekvenser som er spesifikke for dette viruset , sier Ørpetveit.

Distribusjon av IPN-virus i laksenyre

IPN-syk laksesmolt. (Foto: Trygve Poppe)
IPN-syk laksesmolt. (Foto: Trygve Poppe)

For optimalisering og validering av denne metoden, ble den sammenlignet med tradisjonell virusisolering i cellekultur.

Begge metodene ble benyttet for å undersøke hvordan IPN-virus fordeler seg i laksenyre. Fiskenyre er et langt organ som strekker seg langs fiskens ryggrad, gjerne fra hode til hale. Begge metodene viste at hodenyre og midtnyre inneholdt omtrent like mye virus.

– Dette er gode nyheter for de som tar ut prøver til IPN-undersøkelse i felten, fordi prøveuttak fra midtnyre er det minst tidkrevende, sier Ørpetveit.

Krever lagring ved minus 80

De to metodene, virusisolering i cellekultur og real-time RT-PCR, ble også benyttet og sammenlignet i en studie av hvordan ulike prosedyrer for konservering og lagring av nyreprøver påvirker analyseresultatet.

Når det tas ut prøver av laksenyre for undersøkelse for IPN-virus ute i felten, konserveres prøvene enten på et modifisert cellekulturmedium, også kalt transportmedium, eller på RNAlater, som er et RNA-stabiliserende middel.

Noen ganger undersøkes prøvene straks de kommer til laboratoriet, mens de andre ganger lagres og undersøkes senere.

Noen av konserverings- og lagringsprosedyrene gjorde prøvematerialet uegnet for viruspåvisning ved bruk av den ene eller begge metodene.

– Basert på resultatene anbefales det at prøver som tas ut på transportmedium ikke lagres i form av helt vev, men at de homogeniseres (knuses) straks de kommer fram til laboratoriet, sier Ørpetveit.

– All lagring må dessuten foregå ved minus 80° C.

Valg av konserveringsmåte er viktig

Ørpetveit sier at nyrevev konserveres nesten like bra på transportmedium som på RNAlater, men hvis det er stor sjanse for transportforsinkelse, bør prøvene tas ut på RNAlater.

Grunnen til det er at prøver på transportmedium er avhengig av konstant kjøling fra uttak til ankomst ved laboratoriet, og kjøleelementene eller isen som prøvene pakkes sammen med, holder som regel bare i et par dager.

Nyrevev som er konservert på RNAlater kan bare analyseres ved hjelp av molekylærbiologiske metoder, som real-time RT-PCR.

Real-time RT-PCRen viser seg å være minst like sensitiv for påvisning av IPN-virus som tradisjonell virusisolering i cellekultur. Siden real-time RT-PCR er en raskere metode for påvisning av virus, vil den nok i mange sammenhenger erstatte virusisolering i cellekultur.

– Dette gjelder blant annet i forbindelse med undersøkelse av yngel som er for liten for patologisk undersøkelse, og metoden er allerede tatt i bruk i forbindelse med stamfiskundersøkelser, sier Ørpetveit.

Bakgrunn:

Irene Ørpetveit disputerte i desember 2010 for doktorgraden ved Norges veterinærhøgskole med avhandlingen: ”Early events in replication of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV)”. Doktorgradsarbeidet ble utført ved Veterinærinstituttet.